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LN 通過與細胞間的相互作用可直接或間接控制細胞的黏附或轉(zhuǎn)移、增殖或分化、凋亡或胚胎發(fā)育、基因表達等生命活動；LN 具有增強細胞間黏附、加強細胞吞噬的作用，與膠原、肝素、多糖、纖維、細胞及小分子肽等結(jié)合，為細胞提供營養(yǎng)和信息通道，構(gòu)建良好的細胞生存環(huán)境，再生修護表皮、真皮、纖維、色素、毛囊、神經(jīng)、血管等細胞。

目前，關(guān)于層粘連蛋白（LN）在細胞培養(yǎng)、創(chuàng)傷修復(fù)、美容護膚、生物組織材料、臨床診斷等方面的作用及應(yīng)用已得到廣泛論證認可，隨著對層粘連蛋白的不斷深入研究，近年來對層粘連蛋白促進干細胞增殖的特性及應(yīng)用更是受到廣泛關(guān)注。

1.1 文獻檢索和篩選要求 

由作者檢索中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 (CNKI)、萬方數(shù)據(jù)庫、PubMed 以及 Web of Science 等數(shù)據(jù)庫 中相關(guān)發(fā)表的文章，中文檢索詞為“層粘連蛋白”“干細胞”， 英文檢索詞為“l(fā)aminin”“stem cell”，檢索的時間范圍是2010年1月至2019年10月，共檢索到中文文獻 30 篇，英文文獻 1382 篇。 

1.2 文獻篩選標準 

篩選與層粘連蛋白作用機制、干細胞行為變化、軟骨再生組織工程等研究內(nèi)容緊密相關(guān)的文獻，剔除重復(fù)、與主題相關(guān)性較差的文獻。 

1.3 質(zhì)量評估及數(shù)據(jù)的提取 

計算機初檢得到中文文獻 30 篇，英文文獻 1382 篇，經(jīng) 2 名資料收集者互相評估納入文獻的有效性和適用性，通過閱讀文題和摘要進行初步篩選； 排除中英文文獻重復(fù)性研究，以及內(nèi)容不相關(guān)的文獻，最后納入 57 篇文獻進行綜述。

2 結(jié)果 Results

2.1 層粘連蛋白的結(jié)構(gòu)及其表達特征 

層粘連蛋白作為大分子糖蛋白，主要存在于細胞外基質(zhì)中，是由 3 個二硫鍵連接而成的多肽，并且存在 16 種不同的層粘連蛋白異構(gòu)體。層粘連蛋白分子因結(jié)構(gòu)域的數(shù)量、大小和表達組織的不同而變化，賦予各個層粘連蛋白家族成員獨特的功能，對多種細胞活動和信號傳導(dǎo)起著重要的調(diào)節(jié)作用。位于軟骨細胞周基質(zhì)中的各種層粘連蛋白主要由軟骨細胞產(chǎn)生，層粘連蛋白在軟骨組織不同發(fā)育階段表達不同且分布各異。KVIST等發(fā)現(xiàn)在正常軟骨組織的發(fā)育階段層粘連蛋白廣泛分布于新生軟骨組織中，而在正常軟骨組織成熟后則主要分布在軟骨細胞周基質(zhì)中。此外，層粘連蛋白也被證實存在于其他組織如半月板和小鼠顳下頜關(guān)節(jié)纖維軟骨中，此時層粘連蛋白更多的是在周基質(zhì)中分散表達， 與上述層粘連蛋白在確定組分中分布有所不同。以往的研究表明，細胞外基質(zhì)形成障礙是軟骨退化的一個顯著特征。在人骨性關(guān)節(jié)炎的研究中發(fā)現(xiàn)，層粘連蛋白在退化關(guān)節(jié)軟骨中的表達明顯降低甚至消失；在創(chuàng)傷引起的損傷樣軟骨組織中層粘連蛋白也有類似的表達情形。由此得出，在軟骨組織不同的發(fā)育階段，層粘連蛋白的表達與分布也隨時間和空間的不同而變化，并且其表達的降低與軟骨組織的退化密切相關(guān)。 值得一提的是，有學(xué)者在組織工程軟骨組織中也發(fā)現(xiàn)了層粘連蛋白的表達，例如 K?LLMER 等利用骨髓來源間充質(zhì)干細胞形成軟骨組織過程中，發(fā)現(xiàn)骨髓來源間充質(zhì)干細胞在體外培養(yǎng) 3 周后，層粘連蛋白在細胞外基質(zhì)中呈廣泛性彌散式分布；JENG等在山羊軟骨缺損修復(fù)實驗中發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白在修復(fù)組織中廣泛性表達，染色分析顯示其呈分散性表達，顯然有別于正常成熟軟骨中層粘連蛋白集中分布在細胞周基質(zhì)的表達方式。由此可見層粘連蛋白的表達與分布在組織工程軟骨組織與體內(nèi)天然軟骨組織中不是完全相同的。

2.2 干細胞與層粘連蛋白 

干細胞廣義上包括胚胎干細胞、誘導(dǎo)多能干細胞及成體干細胞和祖細胞等。成人間充質(zhì)干細胞屬于成體干細胞，可來源不同的成人組織，如骨髓、滑膜、肌肉、脂肪或牙齒等，具有與胚胎干細胞及誘導(dǎo)多能干細胞類似的成骨、成軟骨以及成脂肪的三系分化潛能。來源于胚胎干細胞或誘導(dǎo)多能干細胞的祖細胞也可以在特殊刺激因子作用下獲得軟骨細胞分化或其他組織細胞分化的潛能，在軟骨組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域扮演著重要的角色。目前各類干細胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究還在繼續(xù)，迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種不同的層粘連蛋白異構(gòu)體對干細胞增殖與分化具有不同的調(diào)控作用，對細胞增殖的調(diào)控作用尤為顯著。 

2.3 層粘連蛋白對干細胞增殖作用的調(diào)控

2.3.1 胚胎干細胞與誘導(dǎo)多能干細胞 

在組織工程應(yīng)用領(lǐng)域， 軟骨成功再生的關(guān)鍵一步首先是在誘導(dǎo)分化前通過促進增殖來獲得足量的干細胞，而胚胎干細胞和誘導(dǎo)多能干細胞作為經(jīng)典的多能細胞，都具有分化成軟骨細胞的巨大潛 能，被廣泛研究用于獲取足量干細胞。層粘連蛋白作為細胞外基質(zhì)的重要組成成分，當其作為基質(zhì)用于胚胎干細胞或誘導(dǎo)多能干細胞培養(yǎng)時，能夠有效地促進相應(yīng)干細胞的復(fù)制、增殖（見圖 1）。

目前人們通過小鼠胚胎干細胞增 殖實驗發(fā)現(xiàn)并比較了不同層粘連蛋白及其異構(gòu)體對胚胎干細胞增殖的影響。DOMOGATSKAYA 等發(fā)現(xiàn)不同的層粘連蛋 白異構(gòu)體對胚胎干細胞的影響是多方面的，并利用平均倍增時間把層粘連蛋白異構(gòu)體對胚胎干細胞增殖所產(chǎn)生的影響做了評估與分析。他們發(fā)現(xiàn)在沒有其他分化抑制劑的情況下， LN-511仍具有支持小鼠胚胎干細胞增殖長達 169d 的強效作用；同時他們分析了促進增殖的可能途徑，證明LN-511是通過與整合素β1( 主要是α6β1和 αVβ1) 的相互作用進而增加小鼠胚胎干細胞的黏附能力及其與基質(zhì)的接觸面積來影響小鼠胚胎干細胞的增殖能力；此外，他們還發(fā)現(xiàn)LN-332也 能促進胚胎干細胞的增殖。由此可以發(fā)現(xiàn)，2 種層粘連蛋白異構(gòu)體 LN-511 與 LN-332 促進胚胎干細胞增殖的能力與胚胎干細胞對這2種層粘連蛋白異構(gòu)體極強的黏附性密切相關(guān)。 MIYAZAKI 等 證明了 LN-E8s 作為最小的功能片段，與完整層粘連蛋白分子相比，促進人胚胎干細胞和人誘導(dǎo)多能干細胞增殖作用更加明顯；同時應(yīng)用整合素拮抗劑證明 LN-E8 片段增加了人胚胎干細胞的黏附性是通過識別整合素α6β1位點；此外，應(yīng)用分子分析方法證明了促進增殖的可能信號途徑是 LN-E8通過刺激人胚胎干細胞及誘導(dǎo)多能干細胞的下游AKT、FAK和ERK1/2信號通路，借此影響細胞黏附、存活和遷移，進而促進人胚胎干細胞及誘導(dǎo)多能干細胞在保持未分化狀態(tài)下的不斷增殖。由此可以得出，層粘連蛋白通過調(diào)節(jié)細胞受體與環(huán)境的關(guān)系進而對胚胎干細胞和誘導(dǎo)多能干細胞增殖起到明顯的促進作用。 

目前雖然很多研究表明在上述體外二維環(huán)境培養(yǎng)情況下，層粘連蛋白能有效促進干細胞增殖，但畢竟與體內(nèi)干細胞存在的三維細胞外基質(zhì)微環(huán)境不同，干細胞在三維微環(huán)境中被大量細胞外基質(zhì)所圍繞。在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中，有研究將層粘連蛋白用于支架的修飾以促進培養(yǎng)細胞所用支架的生物活性，進而為干細胞增殖提供有利的微環(huán)境 。HE等利用層粘連蛋白修飾聚L- 丙交酯支架，發(fā)現(xiàn)更大量層粘連蛋白的加入可促進小鼠胚胎干細胞更加強效地增殖。由此可見在干細胞生長三維微環(huán)境中，層粘連蛋白支架修飾是提高細胞增殖的重要一步，同時細胞增殖跟層粘連蛋白的濃度相關(guān)。此外，NIE等在實驗中證實應(yīng)用層粘連蛋白多層涂層培養(yǎng)能夠促進人誘導(dǎo)多能干細胞的增殖。在最近的另一項關(guān)于層粘連蛋白對大鼠胚胎干細胞向心肌細胞分化的研究中， WANG 等發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白比單層明膠能更加明顯地促進大鼠胚胎干細胞增殖。由此可見三維微環(huán)境下，層粘連蛋白促進干細胞增殖作用同樣顯著。總而言之，無論二維還是三維環(huán)境中，層粘連蛋白作為細胞外基質(zhì)中重要的功能成分，對胚胎干細胞及誘導(dǎo)多能干細胞增殖均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

2.3.2 成體干細胞 

成體干細胞已成為細胞移植、組織再生和組織工程領(lǐng)域重要的細胞來源，在創(chuàng)傷修復(fù)、細胞治療、 組織重建以及器官再生等方面具有巨大的應(yīng)用前景。在脂肪源性干細胞研究中，SANTIAGO 等發(fā)現(xiàn)利用層粘連蛋白衍生的序列對聚己內(nèi)酯進行肽表面修飾，能夠明顯促進成體干細胞快速增殖。類似研究隨后也有報道，如LAM等比較了傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)聚苯乙烯板、基質(zhì)膠、層粘連蛋白、纖連蛋白和聚L- 賴氨酸分別作為附著表面時，發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白處理組與其他幾組相比能明顯促進成體干細胞增殖，產(chǎn)生最多的附著細胞和增殖區(qū)域。此外，許多研究也報道了層粘連蛋白對間充質(zhì)干細胞增殖能力的正向調(diào)節(jié)作用，如 HASHIMOTO 等證實了層粘連蛋白異構(gòu)體LN-332 具有促進人間充質(zhì)干細胞增殖的作用。他們通過測定 4 種不同層粘連蛋白異構(gòu)體對人間充質(zhì)干細胞的增殖作用及當整合素α3和α6相應(yīng)阻斷劑分別或共同存在時對干細胞增殖的影響，分析得出LN-332是通過α3β1及α6β1相互作用進而促進人間充質(zhì)干細胞的有效增殖。MATHEWS 等分析了細胞外基質(zhì)所含不同蛋白成分對人骨髓源性間充質(zhì)干細胞增殖的影響，通過比較層粘連蛋白組與未處理組對人骨髓源性間充質(zhì)干細胞的倍增時間，證明層粘連蛋白能促進人骨髓源性間充質(zhì)干細胞快速增殖。李雙星等將雞骨髓間充質(zhì)干細胞分別加載在包被層粘連蛋白培養(yǎng)皿和傳統(tǒng)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，結(jié)果顯示層粘連蛋白培養(yǎng)體系對雞骨髓間充質(zhì)干細胞擴增能力更強，并且能夠快速獲得大量良好的未分化雞骨髓間充質(zhì)干細胞。HE等 研究發(fā)現(xiàn)用層粘連蛋白修飾的納米纖維支架與單純納米支架相比能更好地促進小鼠神經(jīng)干細胞快速增殖。類似結(jié)果還有很多，如LUO等發(fā)現(xiàn)磷灰石 - 層粘連蛋白涂層培養(yǎng)能夠明顯促進神經(jīng)干細胞增殖；LUO等用共沉淀法制備含有層粘連蛋白的仿生磷灰石生物材料底物，對細胞無毒性且具有良好的生物相容性，同樣能促進神經(jīng)干細胞的增殖。綜上所述，在經(jīng)典的理論中利用層粘連蛋白誘導(dǎo)、促進成體干細胞增殖已經(jīng)被廣泛認可。相比于胚胎干細胞與誘導(dǎo)多能干細胞來源，由此制備干細胞用于解決組織工程細胞來源問題一定程度上減少了取材困難、倫理受限與分化不確定性，仍是未來組織工程或軟骨修復(fù)研究的重點。

2.3.3 祖細胞

由于祖細胞也具有一定程度的分化潛能，使其成為組織工程的另一個重要的細胞來源，因此通過層粘連蛋白調(diào)節(jié)祖細胞增殖進而制備軟骨細胞、促進軟骨形成成為了另一個用于軟骨再生的有效方法。在小鼠畸胎癌來源的軟骨細胞系 (ATDC5) 的研究中，CHOI等發(fā)現(xiàn)小鼠軟骨祖細胞在層粘連蛋白衍生肽涂覆的雜交貽貝黏附蛋白表面 (fp-151) 培養(yǎng)時，層粘連蛋白能明顯增加小鼠ATDC5細胞增殖。此外，KOMURA等發(fā)現(xiàn)固定化LN-111，LN-332的底物可有效促進源自誘導(dǎo)多能干細胞的小鼠神經(jīng)祖細胞的增殖。雖然上述研究提示層粘連蛋白具有促進祖細胞增殖的能力，但是在其他一些研究中也有相反的結(jié)果報道，認為層粘連蛋白通過一定程度減少細胞數(shù)量和擴增期細胞活力，對祖細胞起到抑制作用。ARULMOLI等 發(fā)現(xiàn)人神經(jīng)祖細胞在纖維蛋白和組合有透明質(zhì)酸的支架中生長良好，但當加入層粘連蛋白時，通過免疫染色 Ki-67 定量方法分析結(jié)果顯示層粘連蛋白不能顯著增加細胞增殖。相同的結(jié)論在 ADDINGTON 等所做的部分實驗中得到證實，他們發(fā)現(xiàn)小鼠神經(jīng)祖細胞在涂有層粘連蛋白的表面培養(yǎng)，其數(shù)量并沒有明顯增加。這使得層粘連蛋白對祖細胞增殖的影響似乎并不那么確切。然而，ADDINGTON等所做的另一部分研究中發(fā)現(xiàn) 含有層粘連蛋白、膠原蛋白、硫酸肝素蛋白多糖以及生長因子的基底膜基質(zhì)卻能夠顯著誘導(dǎo)細胞增殖，這一定程度上說明當層粘連蛋白與內(nèi)在生長因子結(jié)合時能夠更好地促進祖細胞的有效增殖。ADDINGTON等探測神經(jīng)損傷修復(fù)機制后發(fā)現(xiàn)添加基質(zhì)細胞因子1α的層粘連蛋白組與未添加基質(zhì)細胞因子1α組相比，神經(jīng)祖細胞增殖明顯更加強烈，推測神經(jīng)祖細胞的強烈增殖是層粘連蛋白與基質(zhì)細胞因子1α共同相互作用所產(chǎn)生的結(jié)果。雖然關(guān)于層粘連蛋白對祖細胞的研究并不像干細胞那樣常見，但這些都說明層粘連蛋白在細胞因子的共同作用下，才能充分發(fā)揮其促進祖細胞增殖的作用， 也提示在三維培養(yǎng)或體內(nèi)時層粘連蛋白對干細胞的增殖作用也許并不是單純的單一通路直接作用，還有復(fù)雜的多因素調(diào)控有待闡明。

層粘連蛋白作為細胞外基質(zhì)中的重要成分，其結(jié)構(gòu)主要由 α、β 和 γ 鏈組成，目前發(fā)現(xiàn)是由 11 個基因編碼的 16 種異構(gòu)體。層粘連蛋白在軟骨發(fā)育過程中主要由軟骨細胞分泌，其在軟骨細胞周基質(zhì)以及其他組分中的表達與分布隨時間和空間的不同而變化，而且在正常軟骨組織、退變的軟骨組織以及組織工程所形成的軟骨組織中，層粘連蛋白的分布也有所不同。由于軟骨組織缺乏直接供應(yīng)的血管而在損傷后自身修復(fù)能力十分有限，但組織工程技術(shù)為其修復(fù)與再生提供了一種很有前景的方法，目前獲得足量的未分化干細胞仍是組織工程技術(shù)成功的關(guān)鍵一步，層粘連蛋白的深入研究逐漸為這一關(guān)鍵步驟提供了可靠的前景思路。一般而言，不同層粘連蛋白異構(gòu)體對干細胞及軟骨祖細胞增殖具有不同的促進作用，雖然負性調(diào)控偶見報道，但可以肯定的是層粘連蛋白在軟骨組織工程研究中依然發(fā)揮著獨特的重要作用。隨著層粘連蛋白異構(gòu)體結(jié)構(gòu)、功能及時空表達的深入研究，將更有利于認識和了解層粘連蛋白，解釋其微觀作用原理，從而更好地應(yīng)用于干細胞培養(yǎng)與軟骨細胞形成，服務(wù)于臨床有關(guān) 軟骨疾病的治療。 

目前將干細胞、生長因子與層粘連蛋白修飾支架結(jié)合的復(fù)合生物支架，在軟骨研究中取得了可喜的成效。胚胎干細胞分化的不確定性或致瘤性使其作為組織工程次級細胞來源選擇，而成體干細胞因其有效的增殖及分化能力，已廣泛用于組織再生研究當中，其中脂肪源干細胞因其來源廣泛研究已較為成熟，SUN 等將髕下脂肪墊、滑膜及皮下脂肪3者來源干細胞的增殖及三系分化能力做了全面性比較，認為在組織再生方面髕下脂肪墊來源干細胞具有抗炎及抗衰老的優(yōu)勢，可以考慮作為一個優(yōu)良的再生細胞來源用于組織工程支架。然而目前植入軟骨組織工程支架上的同種異體細胞會發(fā)生不同程度的免疫反應(yīng)，因此去除細胞外基質(zhì)中的細胞成分被認為能最大程度降低抗原免疫反應(yīng)，有益于后續(xù)軟骨再生。細胞外基質(zhì)具體脫細胞方法、脫細胞外基質(zhì)的成分、特性及相關(guān)作用已有深入綜合性概述，目前發(fā)現(xiàn)脫細胞外基質(zhì)能模擬體內(nèi)天然細胞外基質(zhì)組織，在最大程度降低免疫反應(yīng)的同時為軟骨形成提供一種優(yōu)良的體外三維微環(huán)境，強有力地促進了干細胞增殖或分化。因此制備的干細胞、生長因子與層粘連蛋白修飾的復(fù)合生物支架仍有廣闊的研究前景和發(fā)展思路。